ANNEXE I.

1 Échantillon pour laboratoire et technique de prise d'essai.

1.1 Échantillon pour laboratoire.

La taille de l'échantillon pour laboratoire d'un produit de même nature doit être comprise comme suit :

• Portions unitaires de viande et denrées visées aux articles 2 et suivants, tant au niveau de la fabrication que des points de vente : si possible au moins cinq unités ;

• Conserves : cinq unités ;

• Coquillages : nombre suffisant pour obtenir au laboratoire cinq fois au moins 25 grammes de chair et de liquide intervalvaire.

Nota.

• 1. Le laboratoire doit disposer, pour conduire les analyses complètes, d'environ 500 grammes de produits, soit cinq fois 100 grammes. Ces 100 grammes peuvent être fournis par une ou plusieurs pièces.

• 2. Cas particulier. — Lorsqu'il s'agit d'une production artisanale pour laquelle le prélèvement de cinq échantillons peut s'avérer trop important au regard de la quantité fabriquée, il pourra être procédé à un étalement dans le temps de la prise de ces échantillons.

Toutefois, dans l'éventualité où les premiers résultats se révéleraient d'emblée non satisfaisants, il serait procédé au prélèvement simultané de cinq échantillons.

1.2 Technique de prise d'essai.

La prise d'essai destinée à la préparation de la suspension mère et des dilutions décimales porte :

• Sur les parties superficielles et profondes, notamment pour les produits en tranche, hachés, divisés, les plats cuisinés à l'avance… ;

• Sur la partie profonde du produit pour les viandes (pièces), les produits de charcuterie (pièces) et les poissons entiers, après cautérisation de la surface ;

• Pour les produits laitiers et selon la nature des produits, elle porte sur le produit homogénéisé ou sur les parties superficielles et profondes.

Dans le cas d'examens microbiologiques, à la suite de toxi-infections alimentaires, il est nécessaire de pratiquer la recherche des germes pathogènes, toxicogènes et/ou de leurs toxines aussi bien en surface qu'en profondeur.

2 Interprétation des résultats.

Remarque. — Il convient de retenir que la valeur des méthodes de dénombrement microbien n'est pas absolue, quelle que soit la nature des milieux de culture utilisés. Il est généralement admis que la variabilité peut atteindre 1/2 log. avec les milieux solides et 1 log. avec les milieux liquides.

2.1 Plan à trois classes.

Principe :

Ce plan est ainsi désigné parce que les résultats des examens interprétés sur cette base permettent de fixer trois classes de contamination :

• celle inférieure où égale au critère m ;

• celle comprise entre le critère m et le seuil M ;

• celle supérieure au seuil M ;

m Critère fixé au présent arrêté. Tous les résultats égaux ou inférieurs sont considérés comme satisfaisants ;

M. Seuil limite d'acceptabilité, au-delà duquel les résultats ne sont plus considérés comme satisfaisants, sans que pour autant le produit soit considéré comme toxique. Les valeurs de M sont fixées à :

• M = 10 m lors du dénombrement effectué en milieu solide ;

• M = 30 m lors du dénombrement effectué en milieu liquide ;

n Nombre d'unités composant l'échantillon ;

c Nombre d'unités de l'échantillon donnant des valeurs situées entre m et M.

Application pratique (tenant compte des variations liées à la technique microbiologique, remarque supra) :

La qualité du lot est considérée comme satisfaisante ou acceptable en application de l'article 1er du présent arrêté lorsque, aucun résultat de dépassant M :

• a).  Les valeurs observées sont :

  Figure 1. qualité satisfaisante.

   

• b).  Les valeurs observées sont comprises :

  Figure 2. qualité acceptable.

   

• 1. Figure 3. Les résultats sont considérés comme non satisfaisants :

   

• 2. Dans tous les cas où des valeurs supérieures à M sont observées. Cependant, le seuil de dépassement pour les microorganismes aérobies à + 30° C, alors que les autres critères sont respectés, doit faire l'objet d'une interprétation, notamment pour les viandes, volailles et produits crus.

Lorsque les valeurs sont supérieures à M, les résultats sont considérés comme non satisfaisants. Mais il est bien évident qu'au-delà d'un certain ordre de grandeur, la notion de toxicité s'impose de plus en plus ; en tout état de cause, le produit doit être considéré comme toxique ou corrompu lorsque la contamination atteint la valeur microbienne limite S qui est fixée dans le cas général à m 10³. Pour Staphylococcus aureus, cette valeur S ne doit jamais pouvoir excéder 5 10⁴. Les tolérances liées aux techniques d'analyse ne sont pas applicables aux valeurs de M et de S.

2.2 Plan à deux classes.

Ce plan est ainsi désigné car les résultats des examens interprétés sur cette base permettent de déterminer seulement deux classes de contamination. Ce type de plan, qui n'accepte aucune tolérance, même de caractère analytique, correspond le plus souvent aux expressions :

• « Absence dans » : le résultat est considéré comme satisfaisant ;

• « Présence dans » : le résultat est considéré comme non satisfaisant ; le produit est déclaré impropre à la consommation.

En outre, dans certains cas particuliers mentionnés aux articles 2 et 5 du présent arrêté, il est fait application du plan à deux classes, avec la tolérance analytique.

Nota.

Ce plan est en particulier applicable aux contaminations par salmonella. Cependant, pour les volailles, lorsqu'il s'agit de contamination superficielle, le lot est considéré comme satisfaisant lorsque le rapport d/n <= 1/5, d étant le nombre d'unités de l'échantillon dont les résultats sont positifs.

2.3 Cas particulier des conserves.

Lorsque les conserves à base de denrées animales ou d'origine animale ne répondent pas aux épreuves de stabilité fixées à l'article 8 du présent arrêté, la transposition au lot d'origine ne pourra intervenir que dans la mesure où un plan d'échantillonnage préalablement défini aura été mis en œuvre.

3 Dispositions particulières relatives aux échantillons soumis à la congélation en vue d'une analyse microbiologique différée.

Remarque. — La congélation d'un échantillon (plat cuisiné, viande hachée…) provoque une diminution plus ou moins sensible, selon les cas, du nombre de germes servant de test pour le jugement de la qualité microbiologique telle que définie par la réglementation en vigueur.

Le fait de congeler un échantillon d'un produit réfrigéré peut être de nature à provoquer certains litiges (échantillon réfrigéré jugé inacceptable, alors qu'un échantillon du même lot, mais ayant subi une congélation, se révèle satisfaisant au plan bactériologique). Il convient, pour éviter au maximum l'apparition de cette disparité, de traiter les échantillons dans les conditions suivantes, lorsqu'ils devront être congelés et conservés en l'état, préalablement à leur analyse bactériologique.

3.1 Modalités de congélation et de décongélation.

• a).  Congélation précoce conduite de manière à atteindre la température de - 18° C le plus rapidement possible ;

• b).  Stockage et transport à une température <= - 18° C. La durée de stockage ne doit pas excéder un mois.

• c).  Décongélation rapide à l'air ambiant à une température de l'ordre de 20° C pendant le temps le plus court possible (inférieur à trois heures) sans dépasser le stade où la consistance du produit permet le prélèvement nécessaire à la préparation de la suspension mère (température voisine de 0° C).

ANNEXE II. Méthodes générales d'analyse bactériologique.

1 Préparation de l'échantillon pour essai. Prise d'essai.

Chaque fois qu'il est nécessaire, il est procédé à une homogénéisation du produit à l'aide de techniques et d'appareils appropriés (broyeur-homogénéisateur par exemple).

Les prises d'essai sont effectuées sur l'échantillon homogénéisé en tenant compte de la nature des produits et des opérations analytiques à conduire. Elles sont en principe de 10, 25 ou 50 grammes (dans ce dernier cas 25 grammes sont réservés à la recherche des salmonelles).

2 Suspensions mères et dilutions décimales.

Dans un flacon taré contenant 90, 100 ou 225 ml de diluant, introduire aseptiquement 10 ou 25 grammes de produit afin de réaliser des suspensions au 1/5 ou 1/10. Homogénéiser.

Les diluants suivants sont préconisés :

2.1 Cas général.

Tryptone sel :

Tryptone	1 g
Chlorure de sodium	8,5 g
Eau distillée	1 000 ml

 

Préparation : chauffer lentement jusqu'à complète dissolution, ajuster si nécessaire le pH à 7,0 (+ 0,1), répartir puis stériliser vingt minutes à 121° C ± 1.

Eau peptonée tamponnée :

Bacto peptone	20 g
Chlorure de sodium	5 g
Phosphate disodique	9 g
Phosphate monopotassique	1,5 g
Eau distillée	1 000 ml

 

Stériliser à 12° C ± 1 pendant vingt minutes ; pH final : 7,2.

2.2 Cas des produits laitiers.

Eau peptonée pour le yaourt.

Tryptone-sel pour les laits gélifiés et emprésurés.

Phosphate dipotassique à 2 p. 100 (pH final entre 7,4 et 7,6) pour les crèmes fraîches, les fromages frais et les caséinates.

À partir des suspensions mères, préparer les dilutions décimales en utilisant le diluant correspondant au produit à analyser.

3 Révivification.

À l'exclusion des produits laitiers, si le produit a subi un traitement thermique ou s'il a été congelé ou encore s'il renferme des sels pouvant exercer une action inhibitrice (Na Cl, Na No 3, Na No 2…) après homogénéisation laisser le flacon à la température du laboratoire (20° C ± 2° C) pendant trente à quarante-cinq minutes (optimum quarante minutes).

4 Dénombrement des micro-organismes aérobies à 30° C.

Porter en double 1 ml de l'échantillon pour essai s'il est liquide ou 1 ml de la suspension mère dans le cas des autres produits, dans des boîtes de Pétri stériles (90 à 100 mm de diamètre). Pratiquer de la même manière à partir des dilutions retenues en fonction du produit à analyser.

Couler dans chaque boîte 15 ml de gélose pour dénombrement préalablement fondue et ramenée à 47° C (± 1° C). Bien mélanger inoculum et milieu. Laisser solidifier.

L'ensemble de ces opérations ne doit pas durer plus de quinze minutes.

Nota.

Il est indispensable d'employer des pipettes stériles changées pour chaque dilution et d'homogénéiser à l'aide d'un agitateur pour tubes à essai.

Placer les boîtes retournées dans une étuve à 30° C (± 1° C). Les laisser soixante-douze heures (± trois heures).

Ne retenir pour le dénombrement que les boîtes contenant moins de 300 colonies (et plus de 30 si possible).

En cas d'expertise, se conformer aux dispositions de la norme Afnor V 08-011.

5 Dénombrement des Enterobacteriaceae.

Le dénombrement s'effectue en gélose au cristal violet, rouge neutre, bile, glucose (VRBG).

À partir du flacon contenant la suspension mère (1/5 ou 1/10) porter 1 ml dans deux boîtes de Pétri stériles (90 à 100 mm de diamètre).

Couler 12/13 ml de gélose sélective fondue et ramenée à 47° C (± 1° C). Bien mélanger inoculum et milieu. Laisser solidifier. Couler en surface environ 9 ml de milieu sélectif vierge ramené à 47° C (± 1° C). Laisser solidifier et placer les boîtes retournées dans une étuve à 30 °C (± 1° C). Les laisser vingt-quatre heures (± deux heures). Dénombrer les colonies violettes et vérifier la nature de ces colonies (les entérobactéries sont oxydases et fermentent le glucose).

6 Dénombrement des coliformes.

Les coliformes sont dénombrés soit en milieu solide (gélose désoxycholate lactose), soit en milieu liquide par la technique du nombre le plus probable (NPP) à l'aide du bouillon lactosé bilié au vert brillant réparti dans des tubes contenant des cloches de Durham (10 ml de bouillon par tube).

6.1

Le dénombrement en milieu solide s'effectue à partir du produit s'il est liquide, des suspensions mères dans les autres cas et des dilutions décimales retenues selon la nature du produit en portant 1 ml dans deux boîtes de Pétri stériles (90-100 mm de diamètre).

Couler ensuite 13 ml environ de gélose désoxychoate lactose fondue et ramenée à 47° C (± 1° C). Bien mélanger inoculum et milieu. Laisser solidifier. Recouvrir d'une couche de gélose désoxycholate lactose vierge (9 ml environ), laisser solidifier.

Porter les boîtes retournées à l'étuve à 30° C (± 1° C). Les laisser vingt-quatre heures (± deux heures).

Dénombrer les colonies caractéristiques rouge foncé d'un diamètre supérieur à 0,5 mm en prenant si possible une série de deux boîtes où le nombre est compris entre 15 et 150.

6.2

Le dénombrement en milieu liquide s'effectue en transférant dans trois tubes de milieu sélectif 1 ml du produit s'il est liquide ou de la suspension mère, puis en opérant de la même manière pour les dilutions suivantes :

• Bien mélanger inoculum et milieu.

• Porter les tubes à l'étuve à 30° C (± 1° C). Les laisser vingt-quatre - quarante-huit heures (± deux heures).

Pour chaque dilution (y compris suspension mère et produit liquide) compter les tubes positifs, c'est-à-dire ceux qui présentent un dégagement gazeux dans la cloche de Durham et calculer le nombre le plus probable à l'aide des tables de référence.

En cas d'expertise, se conformer aux indications des normes Afnor V 08-015 et V 08-016.

7 Dénombrement des coliformes fécaux.

(Entérobactéries fermentant le lactose aux températures élevées.)

Il s'effectue :

• Soit en milieu solide, selon les mêmes modalités que pour les coliformes mais en portant les boîtes de Pétri ensemencées à + 44° C (± 0,5° C) durant vingt-quatre heures (± deux heures).

• Soit en milieu liquide (technique du NPP) en repiquant à l'aide d'une anse bouclée les tubes de bouillon lactosé bilié au vert brillant trouvés positifs lors du dénombrement des coliformes, dans les tubes de ce même bouillon.

Les tubes ensemencés sont incubés en bain d'eau à 44° C (± 0,5° C) vingt-quatre - quarante-huit heures (± deux heures).

Compter les tubes positifs, c'est-à-dire ceux présentant un dégagement gazeux dans les cloches de Durham et calculer le nombre le plus probable à l'aide des tables de référence.

8 Dénombrement de Staphylococcus aureus.

À partir du produit, s'il est liquide, de la suspension mère et/ou des dilutions retenues selon la nature du produit, porter 0,1 ml sur deux boîtes de Pétri contenant du milieu de Baird Parker et étaler l'inoculum à l'aide d'un étaleur de verre stérile sur la surface préalablement séchée du milieu. Ce dernier ne doit pas avoir plus de quarante-huit heures et doit être conservé au froid. Pour les produits laitiers, ensemencer 1 ml en milieu de Baird Parker.

Les boîtes sont incubées à l'étuve à 37° C (± 1° C) pendant vingt-quatre puis quarante-huit heures.

Dénombrer les colonies caractéristiques, c'est-à-dire noires, brillantes, d'un diamètre compris entre 0,5 et 2 mm, présentant un liséré blanc opaque, entourées d'une auréole d'éclaircissement du milieu. Certains staphylocoques retrouvés dans les produits laitiers peuvent donner des colonies noires dépourvues d'auréole.

Repiquer au moins cinq colonies pour les soumettre aux tests de la coagulase ou de la thermonucléase.

En cas d'expertise, se conformer aux indications de la norme Afnor V 08-014.

9 Dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs (à 46° C).

Ce dénombrement peut s'effectuer en milieu SPS, TSN ou TSC (Tryptone Sulfite Cyclosérine), ce dernier milieu étant recommandé. En raison de sa relative nouveauté, sa composition est rappelée ci-après :

Préparation du milieu base :

Tryptone	15 g
Soytone	5 g
Extrait de levure	5 g
Métabisulfite de sodium anhydre (S2 O5 Na2)	1 g
Citrate de fer ammoniacal	1 g
Agar-agar	12 g à 18 g
Eau	1 000 ml

 

Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit à 7,6 ± 0,1 à 25° C. Répartir en tubes de 20 × 200 à raison de 19 ml par tube. Stériliser quinze minutes à 121° C ± 1° C. Conserver à 4-5° C au maximum quinze jours.

Solution de D cyclosérine :

D cyclosérine cristallisée	4 g
Eau	100 ml

 

Dissoudre la cyclosérine dans l'eau. Stériliser par filtration.

Préparation du milieu complet :

Au moment de l'emploi, ajouter la solution de D cyclosérine pour obtenir une concentration finale de 400 µ gramme/ml soit 1 ml pour 100 ml de milieu soit 0,20 ml pour 20 ml ou 0,25 ml pour 25 ml de milieu.

10 Dénombrement des streptocoques fécaux. (Ne concerne que les produits de la pêche.)

Il s'effectue en milieu liquide par la technique du nombre le plus probable (NPP).

Ensemencer successivement trois tubes de milieu de Rothe avec 1 ml de suspension mère ou des différentes dilutions au 1/20, 1/200, 1/2000 (trois tubes par dilution).

Faire incuber les tubes à 37° C (± 1° C) vingt-quatre - quarante-huit heures.

Repiquer les tubes positifs, c'est-à-dire ceux montrant une croissance bactérienne, dans des tubes contenant du milieu de Litsky (une anse bouclée).

Faire incuber les tubes à 37° C (± 1° C) vingt-quatre - quarante-huit heures.

Compter les tubes positifs (troubles et/ou avec pastille violette au fond des tubes) pour chaque dilution et calculer le NPP en utilisant les tables de référence.

11 Recherche des Salmonella.

En cas d'expertise se conformer aux indications de la norme Afnor V 08-013. Dans les autres cas, utiliser la technique suivante :

• Préenrichessement : s'effectue en eau peptonnée tamponnée (voir ANNEXE II, 2.1), pendant quatre heures à 37° C (± 1° C) pour les ovoproduits et ceux dont la teneur microbienne initiale est présumée importante, et pendant seize à vingt heures à 37° C (± 1° C) dans les autres cas.

• Le rapport entre la prise d'essai et le volume du milieu doit être 1/10.

• Enrichissement : à partir du milieu de préenrichissement, porter 2 ml :

• Dans deux tubes de bouillon Muller Kauffmann au tétrathionate et vert brillant (20 ml par tube).

• Dans deux tubes de bouillon au sélénite (20 ml par tube).

Faire incuber à 37° C (± 1° C) : un tube de bouillon au tétrathionate et un tube de bouillon au sélénite.

Faire incuber à 43° C (± 1° C) : un tube de bouillon au tétrathionate et un tube de bouillon au sélénite.

Isolement :

• Après vingt-quatre heures et éventuellement quarante-huit heures d'incubation, effectuer, à partir des milieux d'enrichissement, des isolements à la surface de géloses au vert brillant et au rouge de phénol et, si possible, à la surface d'un deuxième milieu sélectif.

• Faire incuber les boîtes à 37° C (± 1° C) pendant vingt heures (± deux heures). Si le développement est insuffisant, poursuivre l'incubation.

• S'il y a présence de colonies caractéristiques ou douteuses, en repiquer un nombre suffisant et les soumettre aux essais biochimiques classiques.

• Adresser les souches repiquées sur gélose nutritive au service des entérobactéries du laboratoire central d'hygiène alimentaire, 43, rue de Dantzig, 75015 Paris.

Nota.

Dans l'éventualité où l'analyse porte sur de nombreux échantillons d'un même lot, une technique simplifiée peut être mise en œuvre. Elle comporte :

• Préenrichissement (sans changement) ;

• Enrichissement :

• Un tube de bouillon tétrathionate incubé à 43° C (± 0,5° C). Isolement ;

• Sur gélose au vert brillant et rouge de phénol seulement.

Remarques générales.

Expression des résultats.

Les résultats des dénombrements doivent être rapportés au gramme ou au ml. En cas de recherche, le poids ou le volume d'inoculum doit être précisé.

Valeur de certains résultats.

En milieu solide les dénombrements donnant un nombre de colonies inférieur à 10 ne peuvent conduire qu'à une approximation numérique de la contamination d'un gramme de produit. Dans ce cas, il convient d'exprimer le nombre de colonies observées pour l'inoculum réellement utilisé.

Milieux de culture.

Afin d'améliorer la fidélité des résultats, il est recommandé d'utiliser les milieux complets déshydratés ou des composants de base déshydratés et de suivre scrupuleusement les prescriptions du fabricant.